ProductInformation
Product Name:EBER mRNA原位杂交DIG染色系统
Product Number: FISH200430SEBER
Store at: 4° C Size; : 100T
A 原位杂交试剂盒使用方法及原理：
原理：
FISH—Cellscience设计的原位杂交，用以显示组织和细胞中mRNA的分布。探针的3，端标记地高辛，5’端标记荧光素。生物素标记的抗地高辛抗体可以与链霉亲和素标记的过氧化物酶或碱性磷酸酶结合，作用于相应的显色底物DAB或NBT/BCIP，显色为棕黄色或蓝紫色，探针5，端标记的荧光素，可以在荧光显微镜492-549nm时发出黄绿色荧光来显示被检测mRNA之信号。此方法的灵敏度可基本上替代放射同位素标记的探针且具有低背景和操作简便的优点。也可以用于Northern和Southern的检测以及原位PCR 。
所用试剂准备：
1 两端标记寡核苷酸SRGAP3探针 既用型 Product Number: 2004EBER 30ug
2 寡核苷酸探针预杂交液 既用型 Product; Number:FISH002 2ml
3 寡核苷酸探针杂交液 既用型 Product Number:FISH002 2ml
3 复合消化液 (P/E)PH:6.4 既用型 Product Number:TSP6044 6ml
4 生物素标记的小鼠抗地高辛既用型 Product Number:DB7405B 6ml
5 高敏过氧化物酶链亲和素复合物既用型 Product Number:AA7419H 6ml
6 DEPC . Product Number:D5758 10ml
7 DAB Kit 浓缩型 Product Number:D5637 3ml
8 2 X SSC 干粉 1000ml
9 0.2 X SSC 干粉 1000ml
注 探针为30ug/支临用前与探针稀释液混合，探针浓度为5-8ug/ml即为杂交液
B mRNA 原位杂交前实验准备
1， 无RNA酶水的处理：1000ml 去离子水中加入1ml的DEPC（注：DEPC加入水中时应为油珠状，此时才能有效灭活RNA酶）37度搅拌24小时以灭活RNA酶，然后高压消毒降DEPC备用。（此水为无RNA酶水用以配制原位杂交时所用的溶液。）
2， 无RNA酶玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。
推荐：多聚赖氨酸包被玻片的制备方法 （粘片剂均须用无RNA酶水配制）
（1）将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05% （也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。注意：①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；②干燥过程中注意避免尘埃污染；③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4℃更长），但仍建议尽早使用。
（2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌，无RNA酶的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0）将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。
（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有 一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4℃或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。
3，标本的防RNA酶的固定 配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0使呈清亮状（滴加），再加入约500ml 2×PBS※，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检 测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。注意：①配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；②加热时，温度不宜过 高，常为60～65℃，否则，PFA降解失效；③配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液 体，固定效果下降，建议尽早使用。4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。常组织块固定4～12h，载片固定时间在10～15min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。原位杂交组织化学技术（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释ISHH的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。在固定剂中,最常用的是多聚甲醛。和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定剂也能获得较满意的效果。对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。各种固定剂均有各自优缺点，如沉淀性（Precipitating）固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。
4， 如预杂交液和探针稀释液4℃保存时出现沉淀或浑浊现象，可于40℃水浴温溶，便可恢复正常，不影响使用。避免冷冻。探针最好现用现配。避免RNase污染和细菌污染。 注探针：-20℃保存。探针分装：30ug/支探针先用100ul DEPC处理ddH2O稀释轻轻混匀后分装20ul/ 支无菌离心管中-20℃避光保存备用。
5, DNA探针需变性但不需防RNA酶处理杂交的温度和时间杂交的温度也是杂交成功与否的一个重要环节 。概述中曾提到DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（melting temperature, 简称Tm）。原位杂交中，多数DNA探针需要的Tm是90℃而RNA则需要95℃。这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交的程序中常规的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于杂交液中。McConaughy报告，反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用调节盐浓度的办法来调节Tm。Tm的计算公式有介绍，由公式的列出也表明了它与盐的浓度、探针的长度、甲酰胺的百分比等诸多因素有关。由于盐和甲酰胺浓度的调节等因素，实际采用的原位杂交的温度在Tm-25℃左右，即比Tm减低25℃，大约在30～60℃之间，根据探针的种类不同，温度略有差异，RNA和cRNA探针一般在37～42℃左右，而DNA探针或细胞内靶核苷酸为 DNA的，则必须在80～95℃加热使其变性，时间5～15min，（有作用报告在105℃微波炉加热使之变性），然后在冰上搁置1min，使之迅速冷却，以防复性，再置入盛有2×SSC的温盒内，在37～42℃孵育杂交过夜。
C 原位杂交溶液的配制
1，试剂盒中杂交液和预杂交液的配制
去离子甲酰胺……………………………..500ml (50%终浓度）
20Xssc (或SSPE）……………………250ml (5X 终浓度）
50X Denhardt…………………………..100ml (5X 终浓度）
10%SDS ……………………………..…….50ml (0.5%终浓度）
变性鲑鱼精DNA…………………..100ug/ml 临用前加
硫酸葡聚糖…………………………………...100g (10%终浓度）预杂交液不加
* DEPC 灭活RNA酶的去离子水 定容至1000ml
Denhardt’s液 通常配成50×储备液
聚蔗糖（Ficoll 400）………………………10g
聚乙烯吡铬烷酮（PVP）….……….………10g
牛血清白蛋白全组份（…………….……….10g
* DEPC 灭活RNA酶的去离子水 定容至1000ml
2, 20Xssc， 2Xssc， 0.2Xssc缓冲液的配制
氯化钠…………………………………………..175.3g (20X)
柠檬酸三钠………………………………………....88.2g (20X)
* DEPC灭活RNA酶的去离子水定容至1000ml 2Xssc，0.2Xssc依次稀释10倍。
3，0.1mol PBS缓冲液的配制
NaCL ………………………4 g KCL ……………………..0.1 g
Na2HPO4.12H2O ..1.445 g KH2PO4; ………….………….0.1 g
*注意：在500ml DEPC 灭活RNA酶的去离子水中依次溶解上述试剂； 5.6%NaCO3调pH至7.2左右 。
4, 0.1mol 枸橼酸缓冲液的配制
枸橼酸三钠……………………….3g 枸橼酸…………………………0.4g
* DEPC 灭活RNA酶的去离子水 定容至1000ml
5, 0.1mol TBS缓冲液的配制
NaCL …………………………8.5 g Tris………….…………………1.2g
* DEPC 灭活RNA酶的去离子水 定容至1000ml 用0.9-1ml乙酸调PH至7.5
6,复合消化液的配制
蛋白酶K（Proteinase K）的消化作用在ISHH中是应用于蛋白消化的关键步骤，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用酶k 1μg/ml(于0.1mol/lTris/50mmol/L EDTA, pH8.0缓冲液中),37℃孵育15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）报告应用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1n HCl 配）37℃、30min进行消化，所 获实验结果优于蛋白酶K。
蛋白酶K………………………100ug 胃蛋白酶……………………….2mg
EDTA Na4……………….0.01g
*溶于0.1mol 枸橼酸缓冲液100ml(灭活RNA酶的去离子水配制的枸橼酸缓冲液）
7,组织细胞打孔液的配制
0.1mol 枸橼酸缓冲液….99.5ml 曲拉通-100………………..0.5ml
8,杂交漂洗液
(a) 2Xssc， 0.2Xssc缓冲液中加入0.1%的吐温-20为第一次洗涤液 （用于预杂交和杂交后）
(b)2Xssc， 0.2Xssc缓冲液不加入吐温-20为第二次和第三次洗涤液（用于预杂交和杂交后）
(c)0.1mol PBS缓冲液中加入0.1%的吐温-20为第一次洗涤液,第二次和第三次洗涤液不加入吐
温-20。
(d)0.1mol TBS缓冲液中加入0.1%的吐温-20为第一次洗涤液第二次和第三次洗涤液不加入吐温- 20。
9, 过氧化氢封闭液
市售的过氧化氢浓度为30%............................................................10ml
* DEPC 灭活RNA酶的去离子水配制的 0.1mol PBS定容至100ml
注意：此液现用现配
D 探针杂交原理
1，组织细胞的通透
在ISHH，整个实验周期是比较长的，实验程序也比较繁杂，而杂交在ISHH整个实验中可被认为是“短兵相接”的一步。杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。因此，杂交是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。
2，探针长度
探针的长度一般应用于ISHH探针的最佳长度应在50～100个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。据报告，长500个碱基的探针，其杂交时间约需20h左右。200～ 500个碱基的探针仍可应用，如超过500个碱基的探针则在杂交前最好用碱或水解酶进行水解，使其变成短的片段，达到实验所需求的碱基数。
3 , 探针浓度和杂交时间
杂交反应的时间可能随着探针浓度的增加而缩短，但在一个相当大的范围内，杂交反应应在4—6h内完成杂交时间不要超过24h反应时间过长，形成的杂交体会自动解链，杂交信号反而会减少。生物素或地高辛标记的探针浓度为5ug-8ug/ml，荧光标记的探针浓度为2.5ug-4ug/ml。
4, 杂交中的Tm值和杂交温度
能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫做链温度或融解温度（Tm）。杂交温度应低于杂交体的Tm20—30℃，原因在于这一温度下的杂交率最好。一般，当杂交液含50%甲酰胺，盐浓度为0.75mol/L左右时，寡核苷酸探针约为37℃。杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性染色。从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在3h左右。Barns等 （1987）报告用DNA探针杂交，其反应完成时间为2～4h。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h，或为简便起见杂交孵育过夜，从现有文献报告看无不良结果。当然，杂交反应的时间与核酸探针长度与组织通透性有关，在确定杂交反应时间应予考虑，并经反复实验确定
5, 杂交严格度
杂交条件的严格度（stringency）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。错配对(mismatch）杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反应亦然。一般来说，低严格度（low stringency）杂交及冲洗条件在Tm -35℃至Tm -40℃之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有
70;%～90%的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。中严格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范围。高严格度（high stringency）为Tm-10℃至Tm-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。有科研工作者用地高辛标记原位杂交技术检测尖锐湿疣中人乳头瘤病毒DNA型别，结果发现在严格条件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的检出率和阳性率明显低于非严格条件下（Tm-35℃）其相差非常明显（P<0.001;）。因为，在严格条件下只有同源性很强的DNA才被检出，而在非严格条件下同源性较低的DNA序列也被检出。因此，他建议对病毒DNA分型需在高严格条件下进行，而低严格条件则可用于对病毒感染进行筛选。
6, 预杂交原理
预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非 特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。
7, 杂交后处理
杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。在原位杂交组织化学的实验程序中，这也是一个重要的环节 。特别因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法检测背景染色（非特异性标记的多少）作为改善漂洗程序的指针 。
E石蜡切片mRNA原位杂交步骤
一，过氧化物酶显色系统
1，石蜡切片脱蜡至水:二甲苯两次,20分钟/次无水乙醇20分钟一次90%乙醇20分钟一次 80%乙醇20分钟一次0.1M PBS冲洗三次 。
2，置打孔液中室温10分钟，给细胞打孔以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利的穿透细胞膜。 0.1M PBS冲洗三次 。
3，置过氧化氢封闭液室温20分钟，以封闭内源性过氧化氢酶。 0.1M PBS冲洗三次。
4，滴加复合消化工作液，覆盖组织表面，室温10-30分钟。（根据实验组织和实验的条件情况确定消化时间和温度，需实验者摸索最佳条件。如条件成熟有利于杂交的顺利完成，具体原理参照“组织细胞的通透性”和“复合消化液的配制”一章。 0.1M PBS冲洗三次 。0.2Xssc洗一次（室温3分钟）。
5，滴加预杂交工作液覆盖组织37度湿盒孵育4小时,注意盖上原位杂交专用盖玻片（预杂交工作液反应时间，需实验者摸索最佳条件，如条件成熟有利于杂交后的背景降低。如预杂交工作液反应时间过长反而影响杂交信号。具体原理参照“预杂交原理”一章。
6，预杂交后的洗涤—— 揭去盖玻片以0.2Xssc室温洗三次，每次洗涤5分钟。
7，滴加杂交工作液（含寡核苷酸探针）覆盖组织37度湿盒孵育过夜。注意：探针浓度和时间需实验者摸索最佳条件，具体原理参照“探针浓度和杂交时间”一章。
8，杂交后的洗涤—— 揭去盖玻片以 2Xssc 37度洗三次，每次洗涤5分钟，0.2Xssc37度洗 三次，每次洗涤5分钟，0.1 mol TBS 37度洗3-5次每次洗涤5分钟。
9，滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液
覆盖组织4度湿盒孵育过夜或37度45分钟。0.1M PBS冲洗三次，每次洗涤5分钟。
10, 滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液
覆盖组织37度湿盒孵育45分钟。 0.1M PBS冲洗三次，每次洗涤5分钟。
11, DAB 显色,光学显微镜下观察至细胞内胞浆阳性颜色与细胞外背景颜色对比度反差明显时蒸馏水洗终止反应。细胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。苏木素复染，胞核为蓝色。
12, 80>90;%>无水乙醇>二甲苯脱水,每步须3-5分钟，中性树胶封片保留。
二，碱性磷酸酶显色系统
步骤同过氧化物酶系统步骤，但在以上第3步置过氧化氢封闭液省去，第10 步为滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，稀释方法也相同。第11 步显色剂为NBT/BCIP 阳性成蓝紫色颗粒反应复染剂为 核固红，胞核为红色。
三，荧光显色方法
步骤同过氧化物酶系统步骤，但在以上第3步置过氧化氢封闭液省去，第8步时,不用继续以后步骤便可以甘油封片荧光显微镜下以激发光492nm时观察到黄绿色荧光。如荧光强度或背景太亮时，可以用0.1mol PBS 多洗若干次。此荧光在4度避光时可以保存一年，荧光不粹灭。
解答详细内容
原位杂交试剂盒使用方法
