当染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

   对照/标本无染色
    ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
    ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
    ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
    ④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
    ⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
    ⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
    ⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
    ⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
    ⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

   弱阳性
    如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
    ① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
    ② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而� DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
    ⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
    ⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。